文章简介原文标题：Single-cell transcriptomics reveals novel chondrocyte and osteoblast subtypes and their role in knee osteoarthritis pathogenesis中文标题：单细胞转录组学揭示了膝骨关节炎发病过程中新的软骨细胞和成骨细胞亚型及其作用期刊：Signal Transduction and Targeted TherapyIF：40.8发表时间：2025年2月相关技术：单细胞转录组；双足小鼠；Micro-CT；多重免疫荧光；Angptl7+软骨细胞；Sparc+成骨细胞
导读
膝关节骨关节炎的发病越来越年轻化，其发病机制复杂，其中软骨的病理性重塑可能是介导退行性病变的关键因素，阐明软骨细胞的重塑调控机制可能为骨关节炎的治疗提供新靶点。近期发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》的一项工作，利用单细胞转录组测，结合 3D 模拟建模、体内、体外实验，深入解析新的软骨细胞亚型在骨关节炎发病中的关键作用。接下来，就让我们一同深入剖析这篇论文的核心要点，了解单细胞转录组测序技术的应用。
研究方法
利用双侧卵巢切除后的双足小鼠构建膝骨关节炎（Knee osteoarthritis，KOA）小鼠，这种小鼠结合运动能模拟绝经后女性 KOA 患者的病理特征，通过检测软骨厚度、OARSI 评分指标评估模型有效性。利用单细胞转录组检测 KOA 小鼠的股骨髁组织，分析细胞类型。对 KOA 小鼠的拉伸实验证实机械应力能减少 ECM 合成并促进软骨细胞退变。构建敲低和过表达 ANGPTL7 的人软骨细胞系，与人脐静脉内皮细胞共培养，检测内皮细胞的血管生成能力。在小鼠胚胎成骨细胞 MC3T3 中敲低和过表达 Sparc，观察细胞成骨能力。收集 KOA 患者的胫骨组织，用免疫组化检测 ANGPTL7、Sparc 表达与 PARSI 评分的相关性。
主要结果与亮点
本研究首次揭示了软骨细胞-内皮细胞互作在 KOA 进展中的作用。联合组织学、影像学、单细胞转录组测序技术，全面解析软骨细胞-内皮细胞-成骨细胞的交互作用机制，避免单一技术的片面性。
图形解读
KOA 患者存在软骨下骨的病理重塑，在 KOA 早期阶段发现血管侵入关节软骨收集 KOA 患者的胫骨组织，采用 Micro-CT 检测骨小梁密度、厚度。采用 H&E 染色、红花素 SO&FG 和免疫组化染色检测骨组织中血管侵入情况，软骨组织沉积情况。
图1：KOA 患者软骨下骨的病理重塑。
采用双侧卵巢切除方法构建绝经后双足 KOA 小鼠模型本研究共有6组小鼠：MN 雄性正常小鼠、MB 雄性双足小鼠、FN 雌性正常小鼠、FB 雌性双足小鼠、FO 切除双侧卵巢的雌性小鼠、FBO 切除双侧卵巢的双足雌性小鼠。上述6组小鼠在10周龄开始建模，到22周龄，每月评估 KOA 表型。H&E 和 SO&FG 染色显示在22周龄时 FBO 组小鼠的关节软骨退行性改变加重，软骨细胞细胞外基质主要成分缺失。
图2：成功构建绝经后双足 KOA 小鼠。
KOA 小鼠模型的行为学检测各组小鼠的步态检测、后肢骨的影像学检测，结果表明22周龄的 FBO 小鼠中 KOA 表型最明显。
图3：各组小鼠的步态分析及 micro-CT 检测。
KOA 小鼠的软骨下骨病理重塑检测采用 InAlyzer 成像系统评估各组小鼠的骨密度、脂肪量及体重。采用 Micro-CT 检测软骨下骨的微结构。利用投射电镜观察股骨髁的成骨细胞形态。结果显示 FBO、FB、FO 小鼠的软骨下骨中成骨细胞数量增加。FBO 小鼠的成骨细胞线粒体肿胀、内质网扩大。软骨下骨处有血管侵入和软骨样组织沉积。
图4：KOA小鼠的软骨下骨病理重塑检测。
采用单细胞转录组检测各组小鼠的股骨髁细胞类型从每组22周龄小鼠的后肢分离股骨髁进行单细胞转录组检测，共分离得到65491个细胞，鉴定了15种细胞类型。
图5：单细胞检测各组小鼠的股骨髁细胞类型。
采用单细胞转录组检测各组小鼠的股骨髁细胞类型采用 AUCell 对六组样本中的“机械刺激反应”通路进行评分，其中 FB 和 FBP 小鼠的评分显著升高。构建各组小鼠的膝关节三维模型，分析机械应力。结果显示22周龄双足小鼠的机械应力高于正常小鼠和 FO 小鼠。同时采用 IonOptix C-Pace EM 拉伸系统构建软骨细胞应力刺激模型，拉伸24小时后，观察到细胞骨架显著变化。
图6：软骨细胞的机械应力刺激加速了软骨的退化。
KOA 小鼠中软骨细胞损伤、血管侵入分析单细胞转录组测序数据，富集分析显示 FBO 小鼠中差异表达基因主要富集在氧化应激、血管生成、衰老、ECM 失调显著相关。利用多重免疫荧光检测血管生成相关基因的表达。
图7：KOA 小鼠的软骨细胞损伤、血管侵入和软骨下骨骨重塑严重。
重点分析各组小鼠中的软骨细胞亚群，并验证其中一种软骨细胞的功能重点分析各组小鼠中的软骨细胞数据，主要有6种软骨细胞亚型,多重免疫荧光证实了软骨细胞特征基因的表达。其中高表达 ANGPTL7 的软骨细胞通过 FGF2-FGFR2 配体-受体通路和内皮细胞存在互作，多重免疫荧光证实两种细胞在空间上接近。并在体外构建了 ANGPTL7 敲低和过表达的软骨细胞系，和人静脉内皮细胞共培养后，观察到可以影响内皮细胞的血管生成。
图8：在膝关节骨性关节炎（KOA）小鼠模型中，Angptl7 与软骨细胞通过 FGF2 – FGFR2 信号通路促进血管生成。
Sparc+的成骨细胞负向调控KOA小鼠的骨矿化和成骨细胞分化单细胞的拟时序分析显示祖细胞中抑制骨矿化的基因在 FBO 小鼠中表达异常，基因 Sparc 在小鼠成骨细胞中表达升高。体外构建敲低和过表达 Sparc 的小鼠胚胎成骨细胞，发现过表达 Sparc 后抑制了成骨细胞分化，敲低促进其分化。
图9：Sparc + OBs 在膝骨关节炎（KOA）小鼠体内负向调节骨矿化和成骨细胞分化。
总结和讨论
利用双侧卵巢切除构建了绝经后骨关节炎小鼠模型，通过单细胞转录组测序技术检测到软骨细胞、成骨细胞中新的特征基因 Angptl7、Sparc，体外实验证实 Angptl7 过表达可加剧软骨细胞退变，并通过 FGF2-FGFR2 通路促进内皮细胞血管生成。临床样本验证也证实这些基因的表达和疾病进展正相关。本文非常好的给我们展示了单细胞测序技术在疾病模式动物中的应用，为后续的验证实验设计以及临床转化提供了思路[1]。原文：1. Liu, Y., et al., Single-cell transcriptomics reveals novel chondrocyte and osteoblast subtypes and their role in knee osteoarthritis pathogenesis. Signal Transduct Target Ther, 2025. 10(1): p. 40.
